肿瘤如何掩藏疼痛：PD-L1/PD-1 通过下调伤害性 神经元活动抑制急慢性疼痛
文章来源：《中国疼痛医学杂志》2017年第23卷10期727-729页，国外医学动态栏目《肿瘤如何掩藏疼痛：PD-L1/PD-1 通过下调伤害性 神经元活动抑制急慢性疼痛》
(Gang Chen, Yong Ho Kim, Hui Li, et al. Nat Neurosci, 2017, 20(7):917-926. 南通大学，张志军 译 高永静 校)
摘 要 程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）通常由癌细胞产生，其通过表达在T 细胞上的受体PD-1抑制免疫功能。然而，PD-L1 和PD-1 是否能调节疼痛和神经元功能并不清楚。本研究显示黑色素瘤和正常神经组织（包括背根神经节，DRG）都能产生PD-L1。在正常小鼠足底注射PD-L1 后，通过PD-1 产生了镇痛效应；而PD-L1 中和抗体或其阻断剂能诱导小鼠产生机械性触诱发痛。Pd1 基因敲除的小鼠表现出热和机械性痛觉过敏。机制上，DRG 伤害性神经元中的PD-1 被PD-L1 激活后诱导酪氨酸磷酸酶 (SHP-1) 磷酸化、抑制钠通道、并激活TREK2 钾通道从而使神经元超极化。PD-L1 也能抑制人类DRG 伤害性神经元的兴奋性。而且，黑色素瘤能产生大量的PD-L1，阻断PD-L1 或PD-1 能使黑色素瘤小鼠产生自发性疼痛和触诱发痛。本研究揭示了PD-L1 作为内源性疼痛抑制剂和神经调质这一新功能。
研究背景
癌痛极大地损害了病人的生活质量。乳腺癌、肺癌和前列腺癌通常会转移至骨，并通过释放致痛性物质导致骨癌痛。这些物质包括质子、缓激肽、内皮素、前列腺素、蛋白酶、生长因子等，如：神经生长因子(NGF) 和血管内皮生长因子(VEGF)，它们与外周神经相互作用导致伤害性神经元（伤害性感受器）敏感性和兴奋性增加。NGF 和VEGF 还能诱导癌症部位疼痛传导神经纤维过度生长。尽管肿瘤产生的促疼痛介质一直备受关注，但肿瘤在转移至骨之前，病人通常不会感到疼痛，如黑色素瘤病人在肿瘤转移之前的疼痛就不常见。因此，不同的癌症，甚至相同的癌症在不同的生长阶段可能会产生不同的疼痛相关介质，这些介质能正向或负向调节疼痛敏感性。很多研究显示，肿瘤（如黑色素瘤）能表达检查点抑制蛋白PD-L1 (CD274)，并通过受体PD-1 抑制T 细胞功能和诱导免疫耐受。最新抗PD-1 和抗PD-L1 的免疫治疗在癌症（黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、卵巢癌等）治疗方面取得了成功。但PD-L1/PD-1通路是否或怎样通过非免疫途径（如对神经元的调节）调节疼痛敏感性还不清楚。初级伤害性感受器和免疫细胞具有某些相似性，都能与免疫细胞相互交流。一方面，伤害性感受器对细胞因子、趋化因子等免疫介质和细菌感染产生反应；另一方面还能表达细胞因子、趋化因子和Toll 样受体(TLRs) 等主要的免疫调节剂。初级感觉神经元上的TLRs 能通过与离子通道相互作用快速地调节疼痛敏感性。在小鼠和人的伤害性神经元是否表达功能性PD-1这一重要的免疫调节剂还不清楚。本文对此进行了研究。研究结果阐明了DRG 中PD-L1/PD-1 抑制疼痛的机制，同时也揭示了黑色素瘤通过表达PD-L1掩盖疼痛的产生。
主要研究结果
1. PD-L1 抑制急性炎症性疼痛并提高正常动物的疼痛阈值
足底注射5% 的福尔马林诱导双时相的自发性疼痛。但当在足底预注射PD-L1 (1 ～ 10 μg) 时，第二时相的疼痛行为被显著抑制，而且高剂量（5或10 μg）还能轻度抑制第一时相的疼痛行为。vonFrey 检测显示，足底注射PD-L1 (5 μg) 能提高正常小鼠对机械性刺激的缩爪阈值。
2. PD-L1 是内源性疼痛抑制剂，通过PD-1 改变基础疼痛阈值恶性肿瘤组织能表达PD-L1，在癌症免疫治疗中PD-1 可作为预测性的生物标志物。ELISA 检测显示小鼠黑色素瘤组织高表达PD-L1（约450 ng/mg）。培养的黑色素瘤细胞也能分泌PD-L1。对正常组织中的PD-L1 的检测显示：非神经组织，如肝、脾、肾中含较高水平的PD-L1（约70 ～ 90 ng/mg）。神经组织中，包括脑、脊髓、DRG，PD-L1 含量约为50 ng/mg。此外，坐骨神经和后爪皮肤中含有少量的PD-L1。原位杂交也显示DRG 神经元中表达Pdl1 mRNA。表明PD-L1 在神经组织和皮肤中广泛存在。非恶性肿瘤组织中内源性的PD-L1 是否参与疼痛调节？小鼠足底注射可溶性PD-1(sPD-1) 中和小鼠后爪中PD-L1 后，诱导了短暂的机械性触诱发痛，但没有出现自发性疼痛。用PD-1 中和抗体RMP1-14 也能诱导出约3 小时的机械性触诱发痛。Nivolumab（也称为Opdivo）是美国食品药品监督管理局批准的完全人化的IgG4 单克隆抗体，其选择性作用于PD-1。
足底注射nivolumab 能诱导机械性触诱发痛。另外，PD-L1 的镇痛作用可被RMP1-14 和nivolumab 阻断， 说明PD-L1 经PD-1抑制疼痛。用Pd1 基因敲除小鼠行为检测显示：Pd1 基因敲除后基础疼痛敏感性增加。PD-L1 诱导的镇痛效应和RMP1-14 诱导的痛觉敏化在Pd1 基因敲除后不再出现。Pd1 基因敲除小鼠DRG 中CGRP，IB4和NF200 表达正常。这些结果表明：① PD-L1 是内源性疼痛抑制物；② PD-L1 经PD-1 产生镇痛效应，③ Pd1 基因敲除小鼠疼痛敏感性改变不是感觉神经元发育缺陷所致。
3. PD-L1 经PD-1 抑制小鼠DRG 神经元的活动原位杂交显示Pd1 mRNA 在DRG 大中小神经元内均表达。免疫组化显示PD-1 蛋白在几乎所有的DRG 神经元内表达。PD-1 免疫阳性信号也存在于CGRP 阳性纤维中。这些结果说明，外周初级感觉神经元能表达PD-1，提示PD-1 具有调节疼痛的神经基础。
通常激活或敏化伤害性感觉神经元（伤害性感受器）诱发疼痛和痛觉过敏，PD-L1/PD-1 信号是否通过调节伤害性感受器活动来抑制疼痛？作者用全细胞膜片钳记录了分离打散的小鼠DRG 的小型神经元的兴奋性（直径 < 25 μm）。结果显示：PD-L1在非常低浓度时(10 ng/ml) 就能快速抑制动作电位的产生，也能提高基强度（引起动作电位的最小电流强度），PD-L1 还能诱导DRG 神经元静息膜电位(RMP) 的超极化效应，这些效应在Pd1 基因敲除后消失，表明PD-L1 经PD-1 调节神经元的兴奋性。而且，Pd1 基因敲除后DRG 神经元的RMP 和动作电位的发放频率增加，表明Pd1 基因敲除小鼠的伤害性感受器兴奋性增强。与完全打散的DRG 神经元相比，整体DRG 能保留细胞外隙中的PD-L1。在整体DRG 上的实验显示，用sPD-1 (30 ng/ml) 中和PD-L1 后，DRG 小型神经元动作电位的放电频率增加。用nivolumab阻断PD-1 也能增加动作电位频率。以上研究表明PD-L1 和PD-1 在调节伤害性感觉神经元兴奋性中非常重要。
4. PD-L1 抑制神经损伤后DRG 神经元的过度
兴奋和神经病理性疼痛神经损伤后初级感觉神经元的过度兴奋与慢性疼痛密切相关。在慢性坐骨神经压迫性损伤(CCI)诱导的神经病理性疼痛小鼠，游离的整体DRG 伤害性神经元兴奋性增加，这种增加能被PD-L1 抑制。而且，鞘内注射PD-L1 减轻了CCI 诱导的机械性触诱发痛和热痛觉过敏。
5. PD-L1 抑制脊髓背角突触传递和损伤诱导的
脊髓神经元的过度兴奋脊髓薄片的全细胞膜片钳记录显示：PD-L1能快速降低脊髓II 外层神经元自发性突触后电流(sEPSCs) 的频率和振幅。而sPD-1 和nivolumab 孵育后增加了脊髓II 外层神经元sEPSC 的频率。PD-L1对sEPSC 抑制作用能被nivolumab 阻断。因此，PD-L1/PD-1 信号在调节脊髓伤害性信息传递中发挥作用。随后，作者检测了PD-L1 在骨癌痛模型上的中枢作用。骨癌细胞浸润2 周后，鞘内注射PD-L1能减轻骨癌诱导的机械性触诱发痛。而且，PD-L1减轻了骨癌诱发的脊髓背角广动力(WDR) 神经元的过度兴奋，但nivolumab 却能增强WDR 神经元的活动。这些数据显示PD-L1 在外周和中枢神经系统均作为神经调质发挥作用；在脊髓背角，PD-L1/PD-1 通过抑制伤害性突触传递和损伤诱导的神经元可塑性调节急慢性疼痛。
6. PD-L1 经SHP-1 调节DRG 神经元的钠电流和TREK2 钾通道
PD-L1 如何调节神经元的兴奋性呢？在免疫细胞，PD-1 被PD-L1 激活后募集酪氨酸磷酸酶（SHP-1 和SHP-2）来介导PD-L1 的作用。鞘内注射PD-L1 后DRG 神经元SHP-1 被激活，并且它们共存在同一神经元内。这个激活作用和PD-L1 的镇痛作用可被SHP-1 抑制剂SSG 阻断。说明DRG神经元SHP-1 不仅是PD-1 下游信号，而且参与PD-L1 镇痛。DRG 神经元钠通道在动作电位和疼痛中起重要作用，实验显示PD-L1 能抑制瞬时钠电流，这种抑制可部分被SSG 阻断。钾通道TREK2 能调节DRG 伤害性神经元RMP。在共表达PD-1 和TREK2 的CHO 细胞上，PD-L1 能使RMP 超极化、增强TREK2 诱导的电流、使反转电位负移。这些作用能被SSG 阻断。表明PD-1 被PD-L1 激活后经SHP-1 通过抑制钠通道和增强TREK2 通道功能来调节神经元兴奋性。
7. 人类DRG 神经元表达功能性的PD-1目前疼痛治疗的转化医学是个难题。进一步在人类DRG 神经元的研究显示，人类DRG 神经元也表达PD-1。而且PD-L1 能抑制人DRG 伤害性神经元的兴奋性，该抑制作用也能被SSG 阻断，与小鼠的结果一致。
8. PD-L1 和PD-1 能掩盖黑色素瘤小鼠的自发性疼痛和触诱发痛黑色素瘤表达大量的PD-L1，而且黑色素瘤小鼠没有癌痛的行为表现。但是，足底注射sPD-1 能很快诱发自发性疼痛和机械性触诱发痛，且导致条件性位置偏好（CPP，作为持续性疼痛检测指标）。然而，免疫指标不受sPD-1 的影响。在坐骨神经注射PD-1 siRNA 能下调DRG 神经元PD-1 表达，并诱导黑色素瘤小鼠出现自发性疼痛和机械性触诱发痛。因而PD-1 的表达足以掩盖黑色素瘤的癌痛。用nivolumab 和RMP1-14 静脉注射后，黑色素瘤小鼠出现自发性疼痛和机械性触诱发痛。SSG 阻断PD-1 下游的信号也使黑色素瘤小鼠出现自发性疼痛。这些发现提示PD-L1 经PD-1 和SHP 来掩藏未转移的黑色素瘤的癌痛。
总 结
目前盛行的观点认为，在癌症微环境中的促疼痛介质能激活或敏化初级传入神经元。本文阐明了癌组织也能产生对抗疼痛的介质PD-L1。PD-L1 不仅由黑色素瘤组织产生，还能由非癌组织产生，如皮肤、DRG、脊髓。正常小鼠外源给予PD-L1 能镇痛，但阻断内源性PD-L1 和PD-1 能致痛。PD-L1 能抑制急性炎症性疼痛，也能通过外周和中枢作用减轻神经病理性疼痛和骨癌痛。本研究还证明PD-L1 是一种神经调质，它经PD-1 调节小鼠和人类DRG 神经元兴奋性以及脊髓部位的突触传递。形态学和电生理学证实小鼠和人类DRG神经元上有PD-1 表达，而且有功能。机制上，小鼠和人类DRG 神经元上PD-1 被PD-L1 激活后抑制动作电位和瞬时钠电流。PD-L1 经PD-1 和SHP以及TREK2 来调节RMPs、导致超极化。在脊髓部位，PD-L1 抑制痛觉神经环路中脊髓II 外层神经元的sEPSCs。PD-L1 还能减轻骨癌诱发的脊髓背角WDR 神经元的过度兴奋。这些都说明PD-L1 作为神经调质在外周和中枢神经系统调节疼痛敏化。由于PD-L1 影响sEPSCs 的频率和振幅，因而PD-1 还可能存在于脊髓和脑的突触后神经元上。考虑到胶质细胞在疼痛病理中的重要作用，也不能排除PD-L1和PD-1 在慢性疼痛状态下调节胶质细胞功能。值得注意的是，PD-L1 抑制病理性疼痛，不仅包括炎症性、神经病理性以及骨癌性疼痛模型，也包括黑色素瘤模型。而且PD-L1/PD-1 轴在掩盖黑色素瘤小鼠疼痛中起重要作用。这些研究发现提醒医生，患有黑色素瘤或其他恶性肿瘤的病人需要在免疫治疗前中后检查病人的疼痛状况。也提醒科研工作者，研究癌细胞释放某些特定的疼痛抑制物将为未来疼痛治疗提供新的途径，PD-L1/PD-1 信号通路可能是其中之一。
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